Investigation of two predicted calcium-binding sites located in the acylated segment of the adenylate cyclase toxin of Bordetella pertussis

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2020, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.A coqueluche ou pertússis, é uma doença respiratória infeciosa de alto contágio, sendo mais comumente conhecida como “tosse convulsa” por causa da tosse característica a ela associada. O agente etiológico principal é a bactéria Gram-negativa Bordetella pertussis, no entanto alguns casos estão associados ao microrganismo relacionado B. parapertussis. O agente pode ser transmitido por gotículas aerossolizadas sendo que, após a inalação, as bactérias colonizam os epitélios respiratórios ciliados das vias aéreas inferiores em humanos, onde exercem um papel na supressão da imunidade do hospedeiro durante as fases iniciais da infeção. Apesar da disponibilidade e do uso mundial de vacinas contra a tosse convulsa, esta continua a ser a doença menos controlada entre as que dispõem de vacinação, mesmo em países com altas taxas de imunização, os quais têm experimentado um aumento nos casos de coqueluche nos últimos anos. Como esta doença pode ser fatal para os recém-nascidos não vacinados, a redução da disseminação da bactéria Bordetella pertussis por meio da compreensão dos seus mecanismos de ação biológica, associado ao desenvolvimento de vacinas mais eficazes contra a coqueluche, poderia ajudar a interromper o ciclo vicioso de colonização e transmissão. As vacinas acelulares (“acellular Pertussis”, aP) atuais contra a tosse convulsa têm na sua composição apenas alguns antigénios selecionados de B. pertussis (toxina pertussis, hemaglutinina filamentosa, pertactina e/ou fímbrias). A ausência da toxina adenilato ciclase (CyaA) na atual formulação das vacinas aP é considerada uma das possíveis causas para a falha cada vez mais aparente no desenvolvimento de uma proteção de longo prazo contra a tosse convulsa em populações altamente vacinadas, em oposição à eficácia das vacinas celulares (“whole-cell Pertussis”, wP) que têm sido usadas há décadas, mas que podem causar distúrbios neurológicos graves, entre outros efeitos colaterais. Isso ocorre porque CyaA aniquila as funções bactericidas das células sentinelas da imunidade inata, paralisando as atividades bactericidas opsonofagocíticas dos fagócitos, tais como neutrófilos e macrófagos. Devido ao seu papel protetor e imunossupressor desempenhado nas infeções por Bordetella, o toxóide CyaA é atualmente considerado um candidato ideal para a inclusão na próxima geração de vacinas aP. B. pertussis produz uma série de fatores de virulência que a permitem superar as funções de defesa imune inatas e adaptativas da mucosa aérea do hospedeiro, tais como as toxinas pertussis e CyaA. CyaA é uma proteína (1706 resíduos aminoacídicos) formada por vários domínios, desempenhando um papel particular nas fases iniciais da infeção por B. pertussis. Possui um domínio catalítico adenilato ciclase (AC) localizado nos ~400 resíduos N-terminais, o qual depende de calmodulina eucariótica (CaM) para a sua atividade enzimática, e uma porção C-terminal (~1300 resíduos) responsável pela translocação deste domínio AC, bem como para o fenótipo hemolítico de B. pertussis. A presença de um segmento de ~100 resíduos ligando os domínios enzimáticos e hidrofóbicos de CyaA (resíduos 400-500) é crucial para a translocação do domínio AC através da membrana plasmática e para a regulação da atividade de formação de poros da toxina. O domínio hidrofóbico, que abrange os resíduos 500 a 700, contém pares de resíduos de glutamato carregados negativamente localizados nos segmentos hidrofóbicos que estão envolvidos no controle da taxa de formação, seletividade catiónica e tamanho dos poros formados por CyaA. Após a acilação específica de resíduos de lisina internos (K860 e K983) por uma aciltransferase (CyaC), a toxina é convertida a partir de um precursor inativo, proCyaA, na sua forma ativa. Estes resíduos de lisina estão localizados na região acilada compreendida entre os resíduos 800 a 1000, e a sua modificação pós-traducional é necessária para as atividades citotóxicas (translocação do domínio AC) e hemolíticas (formação de poros) de CyaA, bem como para a conversão da toxina numa holo-proteína monomérica. A metade C-terminal de CyaA (resíduos 1006 a 1706) compõe o domínio de ligação ao recetor celular e exibe várias características comuns a todas as proteínas pertencentes à família RTX (repeats in toxin), tal como as repetições nonapeptídicas de glicina e aspartato do protótipo GGxGxD (onde x representa qualquer aminoácido). Estas repetições formam os numerosos (∼45) locais de ligação a cálcio de CyaA. Os motivos RTX são intrinsecamente desordenados e são caracterizados por uma carga global média negativa na ausência de cálcio, que é parcialmente neutralizada com a ligação do mesmo, favorecendo uma transição de estrutura desordenada para ordenada. Assim, CyaA é uma proteína de ligação a cálcio que sofre alterações conformacionais após se ligar a este catião. A secreção de CyaA através do invólucro bacteriano envolve um sistema de secreção do tipo I (T1SS), constituído pelas proteínas CyaB, CyaD e CyaE, o qual exibe o mesmo mecanismo de translocação de HlyA, a α-hemolisina da família RTX de E. coli, que usa o aparelho HlyBD/TolC. Após a secreção, a ligação a cálcio presente no meio extracelular leva a alterações conformacionais do domínio de ligação ao recetor celular de CyaA, tornando-se numa estrutura estável. Esta conversão induzida pelo cálcio no domínio de ligação ao recetor é necessária para a atividade biológica de CyaA. Uma vez secretado, este domínio liga-se à subunidade CD11b do recetor CD11b/CD18, que é expresso em células mieloides como macrófagos, células dendríticas, neutrófilos e células NK (“natural killer cells”), e que são os alvos primários de CyaA in vivo. No entanto, CyaA pode-se ligar com eficácia reduzida a uma variedade de outros tipos celulares que não expressam a integrina CD11b/CD18, como eritrócitos ou células epiteliais. Após penetração da membrana da célula eucariótica (contendo ou não o recetor CD11b/CD18), a proteína CyaA liberta o seu domínio AC no citosol da célula alvo. Neste compartimento, a enzima adenilato ciclase é ativada pela ligação da calmodulina citosólica e catalisa uma conversão extremamente rápida (kcat∼2000 s-1) e descontrolada de ATP em cAMP. A acumulação desta molécula de sinalização subverte a fisiologia celular e suprime rapidamente as funções bactericidas dos fagócitos. Paralelamente, a porção hemolisina oligomeriza em poros seletivos para catiões e permeabiliza as células para o efluxo de iões potássio citosólicos. A toxina CyaA é capaz de penetrar as células eucarióticas e realizar atividades citotóxicas e hemolíticas, ambas dependentes de cálcio. CyaA possui duas classes diferentes de locais de ligação ao cálcio, locais de ligação ao cálcio de baixa afinidade, importantes para a atividade citotóxica da toxina, e locais de ligação ao cálcio de alta afinidade, importantes para a capacidade de ligação à membrana e a atividade hemolítica de CyaA. Embora os locais de baixa afinidade estejam localizados no domínio RTX da toxina, a localização dos locais de alta afinidade é ainda desconhecida. Uma análise da região C-terminal do segmento acilado de CyaA (resíduos 908 a 1008) revelou que existem dois blocos de resíduos de aminoácidos com um padrão semelhante ao dos locais de ligação ao cálcio altamente conservados do domínio RTX, exibindo uma sequência consenso GGxGxD. Deste modo, usando mutagénese dirigida, testou-se a hipótese de estes dois blocos de resíduos de aminoácidos no segmento acilado de CyaA formarem os locais de ligação ao cálcio de alta afinidade, os quais desempenhariam um papel fundamental na ligação à membrana e atividade hemolítica de CyaA. Portanto, o presente trabalho teve dois objetivos principais: (1) construção, isolamento e purificação de variantes de CyaA com substituições nos locais previstos de ligação ao cálcio, seguido da sua caracterização funcional em ensaios de atividade e por medições eletrofisiológicas em preparações membranares de bicamadas lipídicas, e ainda (2) construção, isolamento e purificação da parte C-terminal do segmento acilado de CyaA (CyaA908-1008) e suas variantes, bem como a sua caracterização por cromatografia líquida acoplada a análises de espectrometria de massa e de espectroscopia de dicroísmo circular. Neste estudo, conseguiu-se expressar e purificar variantes de CyaA que continham mutações não conservativas em ambos os blocos I e II do segmento acilado da toxina, e comparar as suas atividades (ligação à membrana, translocação do domínio AC e atividade hemolítica) com a proteína nativa. Observámos que algumas das substituições introduzidas aboliram as atividades de ligação e as atividades invasivas da enzima AC, bem como a capacidade de formação de poros de CyaA, tanto em membranas de células de mamíferos, como em membranas artificiais. Além disso, conseguimos expressar e purificar com sucesso o polipeptídeo CyaA908-1008, bem como as suas variantes mutantes que continham mutações nos locais previstos de ligação ao cálcio. Os resultados de espectroscopia de dicroísmo circular nas variantes de CyaA908-1008 indicaram a existência de dois sítios de ligação ao cálcio na toxina CyaA, um localizado no bloco I e outro localizado no bloco II da sua região acilada. Os resultados obtidos são a base para investigações futuras, especialmente para uma caracterização estrutural mais aprofundada da parte C-terminal da região acilada de CyaA, nomeadamente estudos de cristalografia de raios-X e ressonância magnética nuclear.Pertussis, also known as whooping cough, has recently re-emerged as a major threat to the global health despite the existence of high levels of immunization against the causative agent, Bordetella pertussis. The Gram-negative bacterium colonizes ciliated respiratory epithelia of lower airways in humans and appears to excel in suppression of host immunity during early phases of infection. The current acellular pertussis (aP) vaccines against pertussis consist only of a few selected antigens (pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, pertactin and/or fimbriae). The absence of adenylate cyclase toxin (CyaA) in the current aP vaccine formulations likely accounts for the increasingly apparent failure of the aP vaccines to confer a long-term protection against whooping cough in highly vaccinated populations, as opposed to the efficient whole-cell pertussis vaccines that have been used for decades. This is because CyaA annihilates the bactericidal functions of the sentinel cells of innate immunity by paralyzing the opsonophagocytic bactericidal activities of phagocytes, such as neutrophils and macrophages. Due to the protective and immunosuppressive roles performed in Bordetella infections, CyaA toxoid is currently considered an ideal candidate for inclusion in the next generation of aP vaccines. CyaA can enter eukaryotic cells and perform cytotoxic and hemolytic activities, both of which are calcium-dependent. CyaA harbours two different classes of calcium-binding sites, low affinity calcium-binding sites that appeared to be critical for the cytotoxic activity of the toxin, and high affinity calcium-binding sites important for the membrane binding capability and the hemolytic activity of CyaA. While the low affinity sites are located in the RTX (repeats in toxin) domain of the toxin, the location of the high affinity sites is still unknown. Analysis of the C-terminal part of the acylated segment of CyaA (residues 908-1008) revealed that there are two blocks of amino acid residues with a pattern similar to that of the highly conserved calcium-binding sites of the RTX domain, exhibiting a consensus sequence GGxGxD. Therefore, using site-directed mutagenesis, we intended to test the hypothesis that the two blocks of amino acid residues in the acylated segment of CyaA might form the high-affinity calcium-binding sites that could play a key role in CyaA membrane binding (membrane insertion) and pore-forming (hemolytic) activities. Therefore, the present work has two main objectives: (1) construction, isolation and purification of CyaA variants with substitutions in the predicted calcium-binding sites and their characterization by functional assays and by planar lipid bilayer electrophysiological measurements, and (2) construction, isolation and purification of the C-terminal part of the acylated segment of CyaA (CyaA908-1008) and its variants, as well as their characterization by liquid chromatography-mass spectrometry and circular dichroism spectroscopy. In this work, we have been able to express and purify CyaA-derived proteins carrying non-conservative mutations in blocks I and II of the acylated segment of the toxin and compare their activities (membrane binding, AC domain translocation, pore-forming activity) with the wild-type toxin. We observed that some of the introduced substitutions abolished the binding and invasive AC activities, as well as the pore-forming capacity of CyaA on both mammalian cell membranes and artificial planar lipid membranes. Furthermore, we have been able to express and purify a CyaA908-1008 polypeptide, as well as its mutant variants carrying mutations in the predicted calcium-binding sites. Results from circular dichroism spectroscopy on CyaA908-1008 variants indicated the existence of two calcium-binding sites in CyaA, one located in block I and the other located in block II of its acylated region. The obtained results are the basis for future investigation, especially for deeper structural characterization of the C-terminal part of the acylated domain of CyaA, namely X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance studies.Com o patrocínio do Institute of Microbiology of the Czech Academy of Sciences, v.v.i

Nuclear pore complex-mediated modulation of TCR signaling is required for naïve CD4+ T cell homeostasis.

Nuclear pore complexes (NPCs) are channels connecting the nucleus with the cytoplasm. We report that loss of the tissue-specific NPC component Nup210 causes a severe deficit of naïve CD4+ T cells. Nup210-deficient CD4+ T lymphocytes develop normally but fail to survive in the periphery. The decreased survival results from both an impaired ability to transmit tonic T cell receptor (TCR) signals and increased levels of Fas, which sensitize Nup210-/- naïve CD4+ T cells to Fas-mediated cell death. Mechanistically, Nup210 regulates these processes by modulating the expression of Cav2 (encoding Caveolin-2) and Jun at the nuclear periphery. Whereas the TCR-dependent and CD4+ T cell-specific upregulation of Cav2 is critical for proximal TCR signaling, cJun expression is required for STAT3-dependent repression of Fas. Our results uncover an unexpected role for Nup210 as a cell-intrinsic regulator of TCR signaling and T cell homeostasis and expose NPCs as key players in the adaptive immune system

As aulas de matemática com alunos com deficiência auditiva : perspetivas de uma professora e uma intérprete

O abraçar da inclusão colocou vários alunos, que até então se encontravam, na sua maioria, em instituições próprias, na escola regular. Criaram-se escolas de referência para determinadas necessidades educativas especiais (NEE) e tentou-se proporcionar condições para a existência de uma igualdade de oportunidades plena. Com este artigo, pretende-se fazer uma reflexão sobre as perspetivas que uma professora de matemática, a lecionar numa escola de referência para o ensino bilingue, a quem foi atribuída uma turma de alunos com deficiência auditiva (DA), e da intérprete que a acompanhou durante a lecionação dessas aulas, possuem sobre a comunicação com alunos com DA nas aulas de matemática, o papel da intérprete de língua gestual portuguesa (LGP) e as tarefas matemáticas e atividade do aluno. Esta reflexão teve por base entrevistas realizadas à professora e à intérprete e realçam uma grande proximidade relativamente às conclusões de estudos existentes

Proposta de um projeto de investigação sobre a comunicação matemática com alunos com deficiência auditiva : um estudo de caso numa turma do 7.º ano

A nível nacional e internacional constatámos que existe pouca investigação sobre as aprendizagens matemáticas de alunos com deficiência auditiva, e em particular, que relacione a comunicação com a aprendizagem efetiva da matemática em alunos com deficiência auditiva, apesar dos estudos existentes indicarem que estes alunos se encontram desfasados dos seus pares no desempenho em matemática. Nesse sentido, este estudo a que nos propomos procura interligar estas duas áreas distintas que lhe conferem o suporte teórico: a educação matemática e a educação especial. Tendo como finalidade contribuir para conhecer a forma como se processa a comunicação matemática com alunos com deficiência auditiva, pretendemos fazer um levantamento para compreender os padrões de interação presentes, o tipo de tarefas propostas e a forma como é discutida a sua resolução e as diversas representações matemáticas presentes nas aulas, pois considerámos que estas podem constituir barreiras ao nível da comunicação matemática. Pretendemos que esta comunicação promova um espaço de reflexão e discussão sobre esta temática, de onde podem surgir contribuições importantes para a implementação do nosso estudo

A sociedade romana aos olhos de Marcial : uma proposta didáctica de língua e cultura

Relatório da prática de ensino supervisionada, Mestrado em Ensino de Português e Línguas Clássicas, Universidade de Lisboa, 2011O objectivo deste relatório é a apresentação da unidade didáctica de Latim A – 11.º, leccionada nas Escolas Secundárias de Camões e de Sacavém ao 11.º J e LH, no ano lectivo de 2009/2010. Partindo de epigramas de Marcial, que se inserem no grande tema programático de 11.º ano - “Roma e os Romanos – vida e sociedade”, abordou-se algumas das principais estruturas da língua latina. Levando os alunos a reflectir sobre o funcionamento da língua e a sua relação com o português, introduziu-se o infinitivo, a oração subordinada completiva infinitiva, o presente e pretérito imperfeito do conjuntivo e os seus valores expressivos. As estratégias de ensino envolveram a exposição de novos conteúdos sobre aspectos da língua latina, os quais partiram sempre da leitura de textos de Marcial, pois são testemunhos apelativos e lúdicos de uma época. Embora a leitura, análise e tradução de textos tenham sido as actividades mais valorizadas, foram propostos exercícios diversificados no intuito de motivar os alunos e promover a reflexão e análise, a sistematização de conhecimentos, a orientação de processos para a efectiva realização das tarefas, para fomentar uma maior autonomia do aluno no estudo da língua. No final do relatório analisou-se e interpretou-se os resultados obtidos nas actividades realizadas. Tal conduziu a uma ponderação sobre a necessidade de adopção de diferentes metodologias e do recurso a distintos processos de remediação.L‟objectif de ce travail est la réflexion sur la séquence didactique de Latin A (11.ème année de l‟enseignement portugais), présentée dans les Écoles Secondaires de Camões et Sacavém aux 11.ème J et LH, dans l‟année scolaire 2009/2010. En partant de quelques épigrammes de Martial qui s‟insèrent dans un grand thème programatique de la 11.ème année – “Rome et les Romains –vie et société”, on a abordé quelques-unes des principales structures de la langue latine. En amenant les élèves à refléchir sur le fonctionnement de la langue latine et de son rapport avec le portugais, on a introduit l‟infinitif, la proposition subordonnée complétive infinitive, le subjonctif (présent et imparfait) et leurs valeurs expressives. Les stratégies d‟enseignement ont engagé l‟exposition de nouveaux sujets sur quelques aspects de la langue latine, lesquels sont toujours partis de la lecture de textes de Martial, en tant que témoins appélatifs et ludiques d‟une époque. Bien que la lecture, l‟analyse et la traduction de textes aient étè les activités les plus valorisées, on a diversifié les exercices présentés pour éveiller la motivation chez les élèves ayant l‟intention de promouvoir la réflexion et l‟analyse, la systématisation de connaissances, l‟orientation de procédés pour l‟effective réalisation des tâches, afin de fomenter une plus grande autonomie de l‟apprenant dans l‟étude de la langue. À la fin de ce rapport on a analysé et interpreté les résultats obtenus dans les activités réalisées, ce qui a conduit à une pondération sur le besoin d‟adopter des différentes méthodologies et de recourir à des procédés de rémédiation distintifs

Desenvolvimento de um vidrado cerâmico para placas de indução

Mestrado em Engenharia Cerâmica e do VidroNeste trabalho pretende-se desenvolver um recipiente cerâmico vidrado, ao qual será aplicada uma camada condutora e uma ou mais camadas de vidrados de protecção, tornando-o apto para utilização em placas de indução. É composto pela selecção de materiais, tecnologia de aplicação e processamento e estudo de comportamento em serviço duma solução cerâmica que poderá ser utilizada para cozedura de alimentos em placas de indução. Ensaiam-se dois tipos de substrato (porcelana desvidrada e porcelana vidrada) sobre os quais será aplicada uma camada condutora activa à base de prata. Descreve-se a caracterização das pastas de prata e dos vidrados candidatos à função de camada de interface substrato/camada condutora e função protecção da camada condutora. Definem-se as condições de aplicação dos vidrados e da camada condutora por impressão serigráfica e respectivos ciclos de cozedura. Descrevem-se os resultados dos testes de aptidão ao aquecimento por indução e seleccionam-se as amostras para caracterização e realização de ensaios de fadiga. O produto final é caracterizado de acordo com os requisitos de loiça de forno.The main object of this work is to develop a ceramic solution, in wich is applied a conductive layer and one or more layers of glazes intended to protect the first layer in order to make it work in induction cooktops. This work is composed by the materials selection, the appliance and processing technology and the performance study of the solution found so that it could be used for cooking in induction cooktops. A conductive silver based layer is applied and tested on two different substrates (biscuit and glazed porcelain). It describes the characterization of silver pastes for conductive layer and glazes that could be applied as interface layer (porcelain substrate and silver conductive layer) or protective layer for the silver paste layer. The glaze and silver layer application conditions by screen printing are studied as well as firing cycles. After the ability for induction tests, selected samples are submitted to endurance tests. The ceramic solution for induction cooking is finally tested to meet ovenware requirements

Mapping the scientific knowledge of antimicrobial resistance in food-producing animals

Antimicrobial resistance (AMR) can be highlighted as one of the most significant health concerns among the last decades, for which antimicrobial drug use in food-producing animals has contributed as one of the major drivers. Food-producing animals are one of the most important and rapidly expanding commercial agricultural sectors worldwide but there is currently limited knowledge on the temporal and geographical distribution of scientific research on antimicrobial resistance in food-producing animals. We provide a global overview of the spatial and temporal trends of scientific knowledge on AMR in food-producing animals. Peer-reviewed papers of AMR on food-producing animals were retrieved from the Web of Science, systemized and dissected. The final validated dataset contained 1341 occurrences observations covering the 1957–2018 period. There has been a shift of research efforts, both geographically and temporally, emphasizing regional differences in food animal production and changing practices in the food production industry. It becomes evident that many regions have been poorly surveyed, wherein intensified sampling and testing efforts should be most valuable. This systematization of knowledge will be crucial in helping to determine how to optimally allocate limited resources available for AMR monitor and control, aiding in the prediction where the threat of new resistant infections will be greatest. AMR research in food-producing animals in developing countries is markedly growing, reflecting changes in food animals production systems but also posing a particularly significant threat, not only due to intensive animal production, but also exacerbated by poor sanitation. We highlight that the use of antibiotics in food producing animals is pervasive, calling for urgent action. These findings raise the possibility to finetuning key priorities on AMR global issues.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Challenges faced by students with hearing impairment: Who use Portuguese Sign Language in mathematics classes

This study aims to understand which communication challenges are faced by students with hearing impairment in a Mathematics class. Hearing loss can hinder the communication that is established in the context of Mathematics classroom, since teacher and students are not fluent in the same language: teacher’s first language is, mainly, Portuguese, while for students with hearing impairment it is the Portuguese Sign Language (PSL). Given the nature of the research this study follows a qualitative interpretative paradigm, based in a design of a case study with two students with hearing impairment that attended the 6th grade of an inclusive school that is a reference for bilingual education. The results show the communication difficulties experienced by the students which inhibit them from constructing a solid mathematical knowledge, whether in the interpretation of statements or in the interactions they establish, due to the low fluency in Portuguese Language in the written form and in PSL. These students demonstrated poor lexical knowledge in PSL when using the language to work mathematically, specifically with respect to the identification of mathematical terms for which there is no defined gesture